TECNOLOGIA EN PURIFICACION DEL AGUA *

¿Qué son los pirógenos?

El descubrimiento de que la inyección de soluciones acuosas a un paciente podía causar fiebre, data de 1876.

Los agentes responsables de este incremento en la temperatura fueron llamados "pirógenos". Más adelante se descubrió que varias sustancias presentes en el agua podían causar efectos pirogénicos.

Los pirógenos más comunes son endotoxinas (ET), por ejemplo lipo-poliscáridos (LPS) que provienen de fragmentos de la pared celular de bacterias Gram-negativas.

Efectos fisiológicos de los pirógenos en humanos

Se ha observado cierta diversidad de efectos, así como una dependencia de los mismos a la dosis administrada.

En general los pirógenos elevan los niveles de citosinas inflamatorias circulantes, seguido de eventos clínicamente relevantes como fiebre, hipotensión, linfopenia, neutrofilia, niveles elevados de cortisol de plasma y proteínas de fase aguda.

Bajas dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias, sin síntomas clínicamente significativos.

Dosis moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios significativos en la composición del plasma.

La administración de altas dosis de pirógenos puede llevar a choques sépticos, caracterizados por una disfunción cardiovascular, incluyendo la depresión y dilatación del miocardio, la vasodilatación, vasoconstricción, disfunción del endotelio y disfunción de órganos (riñón, hígado, pulmones y cerebro) seguido de la falla de múltiples órganos y muerte.

Las células endoteliales juegan un rol muy importante en la regulación de la hemostasis manteniendo una barrera antitrombótica. El daño celular de las células del endotelio debido a endotoxinas es una implicación de la patogénesis de los choques sépticos, dado que estas células cambian como respuesta al estímulo pirogénico y desarrollan propiedades protrombóticas (alterando la regulación de la trombomodulina, la adherencia de leucocitos y la proliferación y reparación de si mismas, entre otras funciones importantes). La información disponible sugiere que los LPS causan daños irreversibles al endotelio.

Adicionalmente, la introducción intravenosa de LPS en humanos sanos suprimió la respuesta de la citosina en ciertos experimentos in vitro que confirmaron que la síntesis reducida de citosina no fue debida a la tolerancia de la ET, sino a una verdadera reacción de supresión inmunológica.
Pirógenos y aplicaciones de laboratorio:

En vista de que los niveles de pirógenos en agua pueden variar dramáticamente y de que su presencia puede afectar los resultados de experimentos bioquímicos y biológicos (además de los mencionados efectos en pacientes), se han establecido niveles máximos aceptables para contaminantes pirogénicos en agua de laboratorio en estándares ASTM relativos a agua purificada para aplicaciones de laboratorio.

En algunos casos, incluso niveles pequeños de pirógenos pueden alterar dramáticamente los resultados de pruebas biológicas. Este impacto negativo de los pirógenos en agua ha sido demostrado en varios experimentos científicos:

Ø Cultivo de células de mamíferos:
Debido a su naturaleza, las endotoxinas interactúan con las membranas celulares y tienen efectos mayúsculos en las funciones y crecimiento celular. Estos efectos pueden ser causados por la inserción de LPS en la membrana celular, su adhesión a receptores celulares o a proteínas solubles. Ha sido demostrado que el uso de agua libre de pirógenos en los medios para cultivo celular optimiza la viabilidad celular y su crecimiento.

Ø Fertilización in vitro:
El uso de agua ultrapura, libre de pirógenos en la preparación de medios y buffers con lleva un mejor desarrollo del embrión y mayores tasas de fertilización.

Ø Electroforesis:
El agua utilizada para la preparación de reactivos y el enjuague del equipo debe estar libre de pirógenos y otras sustancias orgánicas que podrían afectar adversamente la polimerización de geles o bien la precisión del enfoque isoeléctrico, con lo que pondrían en riesgo la precisión y reproducibilidad de resultados experimientales

Ø Biología molecular:
Técnicas experimentales sensibles, como la PCR, clonación o producción de anticuerpos monoclonales, requieren del uso de agua ultrapura y libre de contaminantes inorgánicos y orgánicos (como pirógenos y ácidos nucléicos).

"Reactividad" y estructura de los pirógenos

Los LPS tienen dos partes principales: una cadena polisacárida hidrofílica con regiones antigénicas, y un grupo lípido hidrofóbico. Dado que la longitud de la cadena polisacárida es variable, el peso molecular de los LPS en sus formas más comunes va de 5,000 a 25,000 daltons.

Estas moléculas son muy estables y pueden soportar temperaturas de 120°C por periodos de hasta 3 horas. También son bastante insensibles a cambios de pH, por lo que se requieren altas concentraciones de ácidos o bases para destruiras en un periodo razonable.

En agua, las moléculas de LPS pueden formar agregados de diferentes tamaños, dependiendo de las condiciones del medio:
Ø En presencia de surfactantes, las ET se rompen en monómeros con pesos moleculares de entre 5,000 y 25,000 Da.

Ø En disoluciones que contienen cationes monovalentes o divalentes, los LPS forman micelas de alto peso molecular (mayor de 300,000 Da) con cadenas de polisacárido hidrofílicas en la superficie de cada micela

Ø En agua ultrapura, de alta resistividad, se forman incluso agregados mayores, permitiendo la remoción eficiente de los LPS por membranas de ósmosis inversa y ultrafiltración.

Medición de Pirógenos en Agua

En un inicio, la presencia de pirógenos en agua y disoluciones acuosas se probaba inyectando la disolución problema a conejos y esperando para observar si se presentaban signos de fiebre. Desde entonces, se han desarrollado métodos más sensibles, particularmente gracias al descubrimiento de que una fracción de la sangre del cangrejo , llamada lisato de limulus amebocita (conocida como LAL por su nombre en inglés: Limulus amebocyte lysate) reacciona con los LPS como agente coagulante.

Hoy en día un método cinético turbidimétrico LAL sensible, ofrece un límite de detección de 0.001 EU/mL.

Producción de agua ultrapura apirogénica:

Dos métodos comunes para producir agua libre de pirógenos son la ósmosis inversa y la ultra filtración (UF).

Para la ultra filtración se requiere de una membrana con un límite de peso molecular nominal (NMWL de su nombre en inglés) suficientemente bajo para lograr la remoción eficiente de endotoxinas.

Las membranas de polisulfona de fibra hueca son compatibles con valores altos de pH y como resultado, pueden ser sanitizadas con NaOH, el único agente limpiador que destruye eficientemente a los pirógenos a través de una reacción de hidrólisis. Estas membranas tienen un NMWL de 5,000 Da, lo que en condiciones normales permite una remoción eficiente de endotoxinas. Experimentos han demostrado que un cartucho de UF con este tipo de membranas usado adecuadamente puede reducir niveles de 40,00 EU/ml de ET en 100,000 veces.

Problemas existentes y reflexiones recientes

Cada vez existen más estudios que confirman que los LPS son sumamente heterogéneos y su tamaño varía en función de las condiciones, por lo que el rango completo de su peso molecular está entre <1,000 Da y varios millones de Da. Esta información incrementa la incertidumbre en el desarrollo de métodos efectivos para remover LPS y hace que sea importante hacer las siguientes reflexiones:

Entre los LPS, algunos que se encuentran comúnmente tienen un radio de Stokes menor que el de la endotoxina purificada, que es la que se utiliza típicamente para calificar los filtros.

En el experimento de introducción intravenosa de LPS en humanos sanos (mencionado anteriormente) la síntesis de citosina en monocitos no regresó a sus niveles normales de control ni siquiera en 24 horas, que fue la duración del experimiento. Esta observación es sumamente interesante dado lo pequeño de la dosis de LPS usada (3 ng/kg, o bien 30 EU/kg de peso corporal), así como el hecho de que el estándar actual de endotoxina para liberación de lotes farmacéuticos parenterales es de 350 EU/dosis.

De este y otros estudios se desprende la posibilidad de que farmacéuticos que cumplan con los estándares de pirogenicidad actuales, sean inmunosupresivos.

Debe considerarse que aún en ausencia de fiebre, ocurren reacciones inflamatorias, lo que hace incluso más importante monitorear estas reacciones a nivel celular.

Una población muy expuesta a este riesgo es la conformada por pacientes en terapias de remplazo, por ejemplo hemofílicos o diabéticos. Otro grupo de pacientes en riesgo incluye gente en traumas severos, por ejemplo: en choque séptico.